D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Kod kulat fitopatogenik Colletotrichum menyebabkan penyakit berbahaya pada kentang dan tomato yang dikenali sebagai bintik hitam anthracnose dan umbi. Dengan ciri morfologi, mereka sering sukar dibezakan dengan penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisma lain; pada buah-buahan tomato hijau, penyakit ini mungkin tidak simptomatik, dan hanya muncul pada buah-buahan merah yang masak. Untuk diagnosis patogen yang cepat dan tepat, sistem ujian PCR masa nyata ditawarkan. Untuk mengembangkan sistem ujian, ditentukan urutan nukleotida gen gliserol trifosfat dehidrogenase 45 C. strain coccodes yang diasingkan dari ubi kentang di wilayah yang berlainan di Rusia.
Berdasarkan hasil yang diperoleh dan analisis urutan serupa spesies lain yang terdapat dalam pangkalan data GenBank, primer spesifik spesies dan probe untuk C. coccodes dirancang. Untuk memeriksa kekhususan sistem ujian yang dibuat, PCR dilakukan dengan DNA yang diasingkan dari kultur murni dari 15 spesies kulat parasit dan saprotrofik yang berbeza yang berkaitan dengan tanaman tomato dan kentang (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Kehadiran DNA coccodes Colletotrichum ditentukan pada siklus ambang 20-27, sementara spesies lain dikesan setelah 40 siklus atau tidak dikesan. Sistem ujian memungkinkan untuk mengesan kepekatan DNA C. coccodes yang lebih dipercayai melebihi 0.01 ng / mm3 dalam campuran PCR yang dianalisis. Dengan menggunakan sistem ujian yang dikembangkan, kehadiran C. coccodes pada daun tomat dengan gejala penyakit kulat dan pada ubi kentang tanpa gejala luaran penyakit disiasat. Daun dengan gejala jangkitan kulat dikumpulkan dari dua ladang yang berlainan di Wilayah Krasnodar, umbi - dari ladang di wilayah Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Satu daun tomato yang mengandungi C. coccodes DNA dijumpai di Wilayah Krasnodar; kehadiran DNA yang signifikan dari patogen ini dikesan pada 5 sampel umbi yang tumbuh di wilayah Kostroma, Moscow, Kaluga.
Pengenalan
Kulat dari genus Colletotrichum adalah fitopatogen berbahaya yang mempengaruhi bijirin, sayur-sayuran, herba, buah-buahan dan tanaman beri. Salah satu spesies di mana-mana genus ini, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, adalah agen penyebab anthracnose dan bintik hitam kentang dan tomato, dan menyebabkan penyakit sejumlah tanaman lain dari keluarga Solanaceae, termasuk. rumpai (Dillard, 1992). C. coccodes menjangkiti semua bahagian bawah tanah tanaman, pangkal batang, daun, dan buah-buahan (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Pada kulit ubi kentang yang dijangkiti, perkembangan bintik-bintik kelabu dengan tepi yang jelas tidak dapat dilihat, di mana titik-titik hitam sporulasi dan mikrosklerotia dapat dilihat dengan jelas. Semasa penyimpanan, bisul dengan kandungan yang dilembutkan dapat terbentuk di pulpa ubi, iaitu. penyakit ini memasuki fasa antraknosa, yang bagaimanapun, sangat jarang berlaku.
Pada masa yang sama, gejala anthracnose (ulser kulit dengan bintik-bintik hitam kecil) adalah tipikal buah tomato. Pada daun, gejala C. coccodes muncul sebagai bintik coklat gelap, biasanya bersempadan dengan tisu kuning (Johnson, 1994).
Perkembangan bintik hitam pada umbi merosakkan penampilan mereka, yang sangat ketara ketika menjual kentang kulit merah yang dicuci. Pengelupasan kulit menyebabkan penyejatan berlebihan dan peningkatan kehilangan simpanan (Hunger, McIntyre, 1979). Kerosakan organ tanaman lain menyebabkan kerugian hasil, yang diperhatikan di kawasan terbuka dan tertutup (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Penyakit yang disebabkan oleh C. coccodes adalah biasa di hampir semua kawasan penghasil kentang di dunia, termasuk Rusia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Pengendalian penyakit ini sukar kerana keberkesanan racun kulat yang ada terhadap C. coccodes dan kekurangan varieti tahan (Baca, Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes dapat bertahan dalam umbi biji (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), biji tomato (Ben-Daniel et al., 2010), bertahan lama dalam tanah, di atas serpihan tumbuhan (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) dan di rumpai (Raid, Pennypacker, 1987). Karya sebilangan pengarang (Baca, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) telah menunjukkan bahawa perkembangan penyakit pada kentang dan tomato banyak bergantung kepada kehadiran inokulum pada biji dan tanah. Oleh itu, untuk meminimumkan kerugian dari penyakit ini, perlu untuk mendiagnosis (termasuk kuantitatif) penyebaran jamur dalam bahan benih, di dalam tanah, pada ubi kentang biji dan biji tomat yang diletakkan untuk penyimpanan. Diagnostik morfologi dalam tanah dan bahan tanaman hanya dapat dilakukan dengan adanya mikrosklerotia, yang bagaimanapun juga terdapat pada jenis kulat lain.
Gejala pada umbi sangat serupa dengan kudis keperakan yang disebabkan oleh kulat Helminthosporium solani. Pengasingan kod kod Colletotrichum dan Helminthosporium solani menjadi kultur murni agak sukar dan memerlukan masa yang lama kerana pertumbuhan lambat pada medium nutrien. Untuk mengenal pasti kod kod Colletotrichum, perlu menggunakan kaedah diagnostik instrumental. Kaedah yang paling mudah adalah tindak balas rantai polimerase (PCR) dan pengubahsuaiannya - PCR masa nyata. Pada masa ini, sistem ujian yang dikembangkan oleh penyelidik Britain (Cullen et al., 2002) untuk wilayah ITS1 rDNA digunakan di Eropah dan Amerika Syarikat. Penggunaannya telah menunjukkan hasil yang baik dalam analisis isolat Rusia (Belov et al, 2018). Walau bagaimanapun, C. coccodes sangat berubah-ubah dan pengesanannya dari satu urutan DNA boleh menyebabkan hasil negatif palsu. Untuk diagnosis yang lebih dipercayai, analisis diperlukan untuk beberapa urutan DNA spesies spesifik, yang berkaitan dengan mana kami telah mengembangkan sistem ujian asli yang memungkinkan untuk mengenal pasti C. coccodes dengan urutan gen dehidrogenase gliseraldehid-3-fosfat.
Bahan dan kaedah
Untuk menilai keberkesanan dan kekhususan sistem ujian yang dibuat, kami menggunakan kultur murni dari 15 spesies kulat yang diasingkan oleh penulis dari sampel daun dan buah tomato, ubi kentang yang berpenyakit (Jadual 1). Untuk pengasingan, organ tanaman dengan gejala jangkitan jamur diambil, tidak lebih dari satu organ per semak.
Sepotong umbi dengan kulit, sepotong buah tomat, dan daun yang terkena diletakkan di bawah mikroskop binokular, setelah itu miselium, spora, atau sepotong tisu dipindahkan ke media agar (wort agar) dalam piring Petri dengan jarum pembedah yang tajam. Isolat disimpan pada agar agar miring dalam tabung uji pada suhu 4 ° C.
Sampel daun tomat dengan gejala penyakit kulat, dimaksudkan untuk analisis, segera setelah pengumpulan (di ladang) ditempatkan dalam etil alkohol 70% di mana ia disimpan sehingga pengasingan DNA. Umbi kentang dihantar ke makmal, dikupas (sekeping 2 × 1 cm) dari mereka, dan dibekukan pada –20 ° С. Disimpan beku sehingga pengasingan DNA.
Kultur kulat murni untuk pengasingan DNA ditanam dalam medium kacang cair. Miselium jamur dikeluarkan dari medium cair, dikeringkan di atas kertas turas, dibekukan dalam nitrogen cair, dihomogenkan, diinkubasi dalam penimbal CTAB, dimurnikan dengan kloroform, diendapkan dengan campuran isopropanol dan 0.5 M kalium asetat, dan dicuci dua kali dengan 2% alkohol. DNA yang dihasilkan dilarutkan dalam air deionisasi dan disimpan pada –70 ° С (Kutuzova et al., 20). Kepekatan DNA diukur menggunakan kit pengukuran DNA HS untuk DNA untai ganda pada Qubit 2017 (Qiagen, Jerman). Sampel alkohol dan beku dikurangkan dalam nitrogen cair, kemudian pengekstrakan DNA dilakukan seperti yang dijelaskan di atas (untuk miselium kultur kulat tulen).
Jadual 1. Asal strain kulat terpakai
Nama cendawan | Tumbuhan, organ | Tempat pilihan |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | ubi kentang | Wilayah Kostroma, ubi kentang generasi ladang pertama, kultivar Red Scarlett |
Kod kod Colletotrichum 4 | daun kentang | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | ubi kentang | Wilayah Magadan, pos. Khemah, ubi kentang |
Cladosporium fulvum | daun tomato | Wilayah Moscow, tomato berbuah besar |
Tomatophila alternatifaria | buah tomato | diserahkan oleh kakitangan makmal mikologi dan fitopatologi Institut Penyelidikan Tanaman All-Russian |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | buah tomato | Wilayah Krasnodar, daerah Krymsky, kelas Krim |
Fusarium oxysporum | akar gandum | Rantau Moscow |
PCR dilakukan pada penguat DTprime (DNA-Technology). Untuk PCR, primer asli dan penyelidikan untuk kawasan spesifik gen gliserol trifosfat dehidrogenase digunakan: primer hadapan Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, primer terbalik Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primer menguatkan wilayah 213 bp.
Reaksi mengambil 50 ng DNA keseluruhan (dalam analisis daun dan umbi) dan 10 ng (dalam analisis DNA kultur kulat tulen). Campuran tindak balas (35 μl) dipisahkan oleh lapisan parafin menjadi dua bahagian: yang lebih rendah (20 μl) mengandungi 2 μl 10 × buffer reaksi (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM setiap deoksinukleotida trifosfat, 7 pmol setiap primer, dan 4 pmol probe pendarfluor yang dapat dihidrolisiskan; bahagian atas mengandungi 1 μl 10 × buffer PCR dan 1 U Taq polymerase.
Pemisahan campuran dengan parafin membolehkan tiub disimpan untuk waktu yang lama pada suhu 5 ° C dan memberikan permulaan yang panas untuk PCR setelah memanaskannya selama 10 minit pada suhu di atas 80 ° C. PCR dilakukan mengikut program berikut: 94.0 ° C - 90 s (1 kitaran); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 kitaran); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 kitaran); 10.0 ° C - penyimpanan.
Keputusan dan perbincangan
Urutan gen gliserol trifosfat dehidrogenase ditentukan dalam 45 strain yang diasingkan dari daun, batang, ubi kentang, dan buah-buahan tomato (Kutuzova, 2018) di berbagai wilayah di Rusia. Urutan semua strain yang dikaji dibahagikan kepada 2 kumpulan yang berbeza dalam dua nukleotida. Urutan nukleotida wakil kedua-dua kumpulan dengan nombor KY496634 dan KY496635 disimpan di GenBank.
Primer coc70gdf, coc280gdr dan probe cocgdz yang dirancang berdasarkannya diperiksa menggunakan program BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) pada semua urutan gen gliserol trifosfat dehidrogenase spesies genus Colletotrichum dan organisma lain yang terdapat dalam pangkalan data GenBank.
Tidak terdapat kawasan DNA organisma lain yang sangat homolog dengan primer dan probe.
Sensitiviti sistem ujian diperiksa menggunakan sampel dengan kepekatan DNA C. coccodes yang berbeza, DNA daun kentang yang dijangkiti anthracnose (dikumpulkan pada tahun 2017 di Mari El, varietas Red Scarlett), dan kulit ubi yang terkena bintik hitam (dikumpulkan di wilayah Kostroma, pelbagai Red Scarlett, Jadual 2). Untuk mengesahkan adanya DNA dalam ubi dan daun kentang, strain C. coccodes diasingkan daripadanya menjadi kultur murni.
Hasil analisis kepekaan sistem ujian menunjukkan bahawa ia dapat digunakan untuk berjaya mendiagnosis keberadaan DNA C. coccodes dalam sampel apabila jumlah kandungannya dalam campuran PCR melebihi 0.05 ng. Ini cukup memadai untuk pengesanan, kerana satu sclerotia mengandung, rata-rata, 0.131 ng, dan satu spora mengandung sekitar 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Sistem ujian yang dikembangkan oleh kumpulan Inggeris (Cullen et al., 2002) menunjukkan kepekaan yang sama (ambang kitaran 34 pada 0.05 ng DNA dan 37 pada 0.005 ng).
Analisis sampel semula jadi yang mengandungi C. coccodes dalam semua kes memungkinkan untuk mendedahkan kehadirannya dalam sampel dengan pasti (Jadual 2). Kaedah yang dicadangkan untuk pengasingan DNA juga berlaku untuk analisis sampel tumbuhan semula jadi.
Jadual 2. Penentuan kepekaan sistem ujian yang dicadangkan untuk mengenal pasti kod kod Colletotrichum untuk PCR masa nyata
Contoh | Jumlah DNA dalam sampel *, ng | Kitaran ambang | C. pengesanan kod kod |
---|---|---|---|
Kod kod Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Kulit ubi 1 | 50 | 32 | + |
Kulit ubi 2 | 50 | 30 | + |
Kulit ubi 3 | 50 | 31.5 | + |
Daun kentang | 50 | 29.5 | + |
Catatan. * Dalam campuran produk PCR.
Kekhususan sistem ujian diuji pada sampel DNA yang diekstrak dari 15 spesies kulat. Semua jenis kulat diasingkan oleh penulis dari buah-buahan dan daun tomato, ubi kentang yang terjejas dan sihat; satu strain diasingkan dari akar gandum (Jadual 1). Di antara spesies yang terpencil dari permukaan buah, terdapat juga spesies yang tidak patogen untuk tomato (contohnya, Phellinus ferrugineovelutinus).
Kajian menunjukkan bahawa DNA C. coccodes dikesan pada siklus ambang 20-27, sementara spesies kulat lain tidak dikesan atau memberi isyarat selepas kitaran 40, yang boleh dikaitkan dengan kesan kebisingan yang tidak spesifik (Jadual 3).
Jadual 3. Memeriksa sistem ujian untuk pelbagai jenis cendawan
Nama cendawan | Kitaran ambang |
Kod kod Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. kod kod 2 | 22.6 |
C. kod kod 3 | 23 |
C. kod kod 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternatif | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineoveltinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Catatan. * Jumlah DNA dalam semua sampel adalah 10 ng.
Sistem ujian yang dikembangkan digunakan untuk mengenal pasti C. coccodes dalam sampel daun tomato dengan gejala patogen nekrotrofik dan ubi kentang biji tanpa gejala yang dapat dilihat. Untuk kajian ini, kami mengambil ubi biji dari pelbagai jenis yang ditanam di wilayah Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Kehadiran DNA C. coccodes dianggap signifikan dalam sampel, dalam analisis yang mana siklus ambang tidak melebihi 35. Nilai ambang ini dipilih berdasarkan penentuan yang boleh dipercayai dari 0.05 ng DNA C. coccodes (siklus ambang 33.5, Jadual 2) dan fakta bahawa tahap ambang melebihi 40, DNA spesifik dari beberapa spesies kulat lain didiagnosis. Dengan pendekatan ini, kehadiran DNA C. coccodes yang ketara dapat dikesan pada 5 sampel umbi yang tumbuh di wilayah Kostroma, Moscow, Kaluga dan dalam satu daun tomato dari daerah Yeisk di wilayah Krasnodar (Jadual 4, 5).
Jadual 4. Pengesanan kod kod Colletotrichum pada ubi kentang *
Nombor sampel | Varieti kentang | Tempat pertumbuhan | C. pengesanan kod kod | Kitaran ambang |
---|---|---|---|---|
1 | Scarlet Merah | Rantau Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Rantau Moscow | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky awal | Rantau Moscow | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | rantau Kaluga. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasy | rantau Kaluga. | - | |
15 | Gala | rantau Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Catatan. * Jumlah DNA dalam semua sampel adalah 50 ng.
Jadual 5. Pengesanan kod kod Colletotrichum pada daun tomato *
Nombor sampel | Tempat pertumbuhan | C. pengesanan kod kod | Kitaran ambang |
---|---|---|---|
1 | Wilayah Krasnodar, Daerah Crimean | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Wilayah Krasnodar, Daerah Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Jumlah DNA dalam semua sampel adalah 50 ng.
Sistem ujian yang dibuat oleh kami tidak kalah dengan yang dikembangkan oleh penyelidik Britain (Cullen et al., 2002) dalam kepekaan dan kekhususan dan sesuai untuk analisis sampel tumbuhan. Penerapannya untuk analisis umbi umbi memungkinkan untuk mengenal pasti DNA C. coccodes pada umbi tanpa tanda-tanda kerosakan luaran dan berjaya menganalisis jangkitan daun.
Sehingga kini, belum ada analisis ubi kentang untuk serangan kod C. C. yang dilakukan di Rusia. Kajian pertama kami menunjukkan bahawa daripada 16 umbi benih yang diuji yang tumbuh di pelbagai wilayah di Persekutuan Rusia, 5 mengandungi C. coccodes. Ini menunjukkan bahawa bintik hitam ubi kentang adalah penyakit kentang yang biasa terjadi di Rusia, dan perannya dalam mengurangkan jumlah dan kualiti tanaman kentang diremehkan.
Analisis daun tomato menunjukkan terdapatnya DNA C. coccodes yang signifikan dalam satu daun dari daerah Yeisk, Wilayah Krasnodar. Sebelumnya, ketika memeriksa ladang tomat di Rusia selatan menggunakan sistem ujian Inggeris (Cullen et al., 2002), daun yang mengandungi C. coccodes dijumpai, dan di beberapa ladang terdapat sebilangan besar daun yang dijangkiti C. coccodes (Belov et al., 2018). Di Wilayah Krasnodar dan Primorsky, Wilayah Moscow, kami menjumpai buah tomato, dari mana kami berjaya mengasingkan kultur C. coccodes yang murni. Ada kemungkinan bahawa C. coccodes jauh lebih meluas pada tomato di Rusia daripada yang diyakini sekarang, dan keburukannya juga dipandang rendah.
Sehingga kini, maklumat yang cukup telah terkumpul mengenai penyebaran C. coccodes secara meluas pada kentang dan tomato.
Untuk lebih memahami peranan jamur ini dalam perkembangan penyakit kentang dan tomat, perlu memantau kelazimannya di Rusia, mempelajari peranan jangkitan tanah dan benih, dan peranan bintik hitam dalam kerugian semasa penyimpanan. Penggunaan diagnostik PCR dapat memudahkan kerja ini, dan penggunaan serentak kedua sistem ujian ini akan meningkatkan ketepatan analisis dengan ketara.
Karya ini disokong oleh geran dari Yayasan Sains Rusia No. 18-76-00009.
Artikel itu diterbitkan dalam jurnal "Mycology and Phytopathology" (jilid 54, No. 1, 2020).