MAKAN. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Baru-baru ini ditunjukkan bahawa kulat ascomycete Ilyonectria crassa mampu menjangkiti ubi kentang. Karya ini adalah yang pertama menganalisis ciri biologi dan ketahanan terhadap beberapa racun kulat strain I. crassa yang diasingkan dari kentang. Urutan kawasan spesifik spesies strain "kentang" bertepatan dengan yang diperoleh sebelumnya untuk kulat yang diasingkan dari akar daffodil, ginseng, aspen dan beech, bunga bakung dan daun tulip. Ternyata, banyak tanaman liar dan kebun boleh menjadi cadangan I. crassa. Strain yang disiasat dijangkiti hirisan tomato dan kentang, tetapi tidak menjangkiti keseluruhan buah tomato dan ubi kentang yang utuh. Ini menunjukkan bahawa I. crassa adalah parasit luka. Penilaian ketahanan terhadap fludioxonil, difenoconazole dan azoxystrobin pada medium nutrien menunjukkan keberkesanan ubat ini tinggi.
Indikator EC50 (kepekatan fungisida, yang melambat sebanyak 2 kali kadar pertumbuhan radial koloni berbanding dengan kawalan bukan fungisida) adalah sama dengan 0.4; 7.4 dan 4 mg / l, masing-masing. Kemungkinan perkembangan penyakit yang disebabkan oleh I. crassa harus dipertimbangkan ketika penilaian fitopatologi umbi kentang dan pengembangan langkah-langkah perlindungan tanaman.
Perkembangan mikroorganisma fitopatogenik menyebabkan kerugian yang tinggi pada semua peringkat menanam dan menyimpan kentang. Semasa merancang langkah-langkah perlindungan, sebagai peraturan, patogen terkenal diambil kira, seperti spesies genera Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, dll. Namun, dalam beberapa tahun kebelakangan ini, semakin banyak laporan muncul mengenai kemunculan mikroorganisma fitopatogenik baru pada kentang. Biologi mereka kurang dipelajari, keberkesanan racun kulat yang digunakan pada kentang berkaitan dengannya tidak diketahui, kaedah diagnostik belum dikembangkan. Dengan perkembangan yang besar, mereka mampu menyebabkan kerosakan yang besar pada tanaman kentang. Salah satu mikroorganisma ini adalah kulat ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, yang pertama kali ditemui oleh penulis pada ubi kentang (Chudinova et al., 2019).
Karya ini membentangkan hasil analisis strain I. crassa yang diasingkan dari ubi kentang. Morfologi koloni dan struktur miselium I. crassa, urutan nukleotida kawasan DNA spesies spesifik, virulensi terhadap kentang dan tomato, dan ketahanan terhadap beberapa racun kulat yang popular telah dikaji.
Bahan dan kaedah
Kami menggunakan strain I. crassa 18KSuPT2 yang diasingkan pada tahun 2018 dari ubi kentang yang dijangkiti yang tumbuh di wilayah Kostroma. Umbi terkena jenis busuk kering dengan rongga ditutupi miselium coklat muda. Dengan menggunakan jarum pembedah steril, miselium jamur dipindahkan ke dalam piring Petri dengan medium agar (bir wort 10%, agar 1.5%, penisilin 1000 U / ml). Plat diinkubasi dalam gelap pada suhu 24 ° C.
Mikroskop cahaya Leica DM2500 dengan kamera digital ICC50 HD dan mikroskop teropong Leica M80 dengan kamera digital IC80HD (Leica Microsystems, Jerman) digunakan untuk memotret, menilai ukuran dan morfologi spora dan organ spora.
Untuk mengasingkan DNA, miselium jamur ditanam dalam medium kacang cair, kemudian dibekukan dalam nitrogen cair, dihomogenkan, diinkubasi dalam penyangga CTAB, dimurnikan dengan kloroform, dan dicuci dua kali dengan 2% alkohol.
Kaedah pengekstrakan DNA dijelaskan secara terperinci dalam artikel oleh Kutuzova et al. (2017).
Untuk menentukan spesies dengan kaedah molekul dan membandingkan dengan strain I. crassa lain yang diketahui, PCR dilakukan dengan primer yang membolehkan penguatan kawasan DNA spesies spesies: ITS1-5,8S-ITS2 (primer ITS5 / ITS4, White et al., 1990), kawasan gen b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) dan faktor pemanjangan terjemahan 1α (tef1α) (primer EF1-728F / EF1-986R, Carbone dan Kohn, 1999). Amplicon dengan panjang yang diinginkan diekstrak dari gel menggunakan kit Evrogen CleanUp. Kawasan yang diperkuat diurutkan menggunakan Kit Penentuan Kitaran BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, CA, USA) pada alat urutan automatik Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Urutan nukleotida yang dihasilkan digunakan untuk mencari padanan dalam pangkalan data GenBank Pusat Maklumat Bioteknologi Nasional AS (NCBI). Analisis filogenetik dilakukan menggunakan program MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Penentuan virulensi dilakukan pada buah-buahan hijau keseluruhan buah tomato besar (Dubrava pelbagai) dan ubi kentang (varieti Gala). Sebagai tambahan, untuk mensimulasikan kerosakan pada buah dan ubi yang rosak, kami menggunakan potongan buah dan ubi yang sama. Sepotong ubi diletakkan di ruang lembap, yang merupakan piring Petri dengan kertas saringan basah di bahagian bawah. Slaid diletakkan di atas kertas, yang pada gilirannya, potongan ubi atau buah diletakkan. Seluruh ubi dan buah-buahan juga diletakkan di dalam bekas dengan kertas saringan basah di bahagian bawah. Di tengah-tengah kepingan (atau di permukaan ubi atau buah yang utuh), sebiji agar (5 × 5 mm) dengan hifa jamur diletakkan setelah 5 hari tumbuh pada agar-agar wort.
Penilaian ketahanan strain kulat terhadap racun kulat dilakukan dalam keadaan makmal pada medium nutrien agar. Kami mengkaji kerentanan terhadap ubat fungisida Maxim, KS (bahan aktif fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Katalog negeri ..., 2020). Penilaian dilakukan dalam piring Petri pada medium wort-agar dengan penambahan ubat yang dikaji pada kepekatan bahan aktif 0.1; satu; 1 ppm (mg / L) (untuk fludioxonil dan difenoconazole), 10; sepuluh; 1 ppm (untuk azoxystrobin) dan dalam media tanpa racun kulat (kawalan). Fungisida tersebut ditambahkan ke medium cair dan disejukkan hingga 10 ° C, setelah itu media tersebut dituangkan ke dalam piring Petri. Blok agar dengan miselium jamur diletakkan di tengah-tengah piring Petri dan dikultur pada suhu 100 ° C dalam gelap. Setelah 60 hari inkubasi, diameter koloni diukur dalam dua arah yang saling tegak lurus; hasil pengukuran bagi setiap koloni adalah rata-rata. Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga. Berdasarkan hasil analisis, EC24 dihitung, sama dengan kepekatan fungisida, yang mengurangkan separuh pertumbuhan radial koloni berbanding dengan kawalan fungisida.
Keputusan dan perbincangan
Pada piring petri dengan agar-agar wortel, kulat membentuk koloni dengan miselium flocculent putih. Medium di bawah miselium berubah menjadi merah-coklat. Apabila medium mengering, kulat membentuk spora dua jenis pada conidiophores tunggal dan agregat dalam sporodokia kecil. Makroconidia memanjang, berbentuk silinder, dengan satu hingga tiga septa, panjang rata-rata 27.2 µm dengan julat nilai dari 23.2 hingga 32.2 µm, lebar - hingga 4.9 µm (Gbr. 1). Panjang rata-rata mikrokonidia adalah 14.3 µm dengan julat nilai dari 10.3 hingga 18.1 µm, lebarnya hingga 4.0 µm. Semua watak makro dan mikromorfologi sesuai dengan pelbagai variasi spesies Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Urutan kawasan DNA spesies spesies (ITS, b-tubulin, TEF 1α) bertepatan sepenuhnya dengan urutan strain I. crassa yang kami kaji sebelumnya (Chudinova et al., 2019, Jadual 1). Untuk mengkaji prevalensi I. crassa di wilayah lain dan menganalisis spektrum budaya yang terjejas, urutan DNA serupa dalam pangkalan data GenBank dianalisis (Jadual 1). Pertindihan adalah 86 hingga 100%. Urutan ketiga-tiga kawasan DNA strain I. kentang "kentang" sama dengan urutan strain yang diasingkan dari akar bola bunga dan akar narsisis di Belanda dan dari akar ginseng di Kanada. Kami tidak dapat menemui strain I. crassa lain dengan tiga urutan analog yang dianalisis dalam pangkalan data terbuka. Walau bagaimanapun, analisis urutan ITS dan b-tubulin yang didedahkan menunjukkan adanya I. crassa pada daun tulip di UK. Kulat dengan urutan ITS yang serupa dikenal pasti semasa menganalisis mikobiota akar aspen di Kanada dan akar beech di Itali, dan ubi kentang di Arab Saudi (Jadual 1). Hasil kajian ini menunjukkan bahawa I. crassa mempunyai taburan global dan mampu menjangkiti pelbagai spesies tumbuhan.
Semasa menentukan patogenik pada irisan tomato dan kentang pada hari ke-5, diameter lesi mencapai 1.5 cm. Strain yang disiasat tidak menjangkiti keseluruhan buah tomato dan ubi kentang yang utuh. Walau bagaimanapun, sepal terkena pada tomato. Untuk mengecualikan kemungkinan pencemaran dari miselium yang dikembangkan pada potongan ubi kentang, isolat jamur diasingkan menjadi kultur murni. Ia sama dengan ketegangan ibu bapa. Nampaknya, I. crassa adalah parasit luka.
Rawatan pra-penanaman ubi benih dengan racun kulat mengurangkan perkembangan penyakit pada tanaman semasa musim tanam. Untuk pemilihan racun kulat yang berkesan, penting untuk menilai yang mana yang berkesan terhadap I. сrassa. Hasil kajian mengkaji bahan aktif racun kulat yang meluas - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil diformulasikan dalam beberapa campuran yang digunakan untuk mengganti biji dan umbi benih sebelum menanam. Fludioxonil (Maxim) juga digunakan untuk merawat ubi biji sebelum disimpan. Difenoconazole dan azoxystrobin juga termasuk dalam sejumlah persiapan yang digunakan untuk memproses bahan benih, dan juga dalam persediaan yang dimaksudkan untuk memproses tanaman vegetatif (Katalog negeri ..., 2020).
Kadar pertumbuhan I. crassa dikaji pada media (Gambar 2) dengan kepekatan bahan aktif yang berbeza: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), dan difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Jadual 2). Persediaan ini boleh dianggap sangat berkesan terhadap I. crassa, kerana EC50 mereka jauh lebih rendah daripada kepekatan sediaan yang disyorkan dalam cecair kerja yang digunakan untuk merawat umbi. Menurut Katalog Negeri ... (2020), kepekatan fludioxonil dalam cecair untuk merawat ubi kentang adalah dari 500 hingga 1000 ppm, azoxystrobin (dalam cecair untuk merawat bahagian bawah alur) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (dalam cecair untuk merawat tanaman vegetatif) - 187.5– 625 ppm.
Jadual 1. Kesamaan urutan urutan spesifik spesies strain 18KSuPT2 dan strain Ilyonectria crassa yang terdapat dalam pangkalan data Genbank
Terikan | Tumbuhan tuan rumah, tapak perkumuhan | Nombor urutan disimpan di GenBank, peratusan persamaan | Link | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 dan 18KSuPT2 | Ubi kentang, wilayah Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, karya ini |
CBS 158/31 | Akar Narcissus, Belanda | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Mentol Lily, Belanda | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Akar Ginseng, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Daun tulip, UK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Akar Aspen, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Beech, Itali | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Penyerahan terus |
KAUF19 | Ubi kentang, Arab Saudi | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = tidak disimpan
Jadual 2. Rintangan Ilyonectria crassa terhadap racun kulat
(bahan aktif) | EC50, ppm | ||||
Hari 3 | Hari 5 | Hari 7 | |||
Kawalan | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Dalam kerja kami, strain I. crassa diasingkan dari ubi kentang di wilayah Kostroma dan Moscow (Chudinova et al., 2019). Sebilangan besar strain kulat dengan urutan ITS yang serupa dengan I. crassa terungkap ketika menganalisis mikobiota ubi kentang di Arab Saudi (Gashgari dan Gherbawy, 2013). Rupa-rupanya, I. crassa tidak begitu jarang pada kentang seperti yang kelihatannya. Eksperimen kami menunjukkan bahawa kulat boleh menjangkiti buah tomato yang rosak. Telah diketahui dari literatur bahawa I. crassa mampu berkembang secara saprotrofik di dalam tanah (Moll et al., 2016), serta menjangkiti pelbagai jenis tumbuhan, bahkan yang jauh secara taksonomi seperti daffodil, lili, ginseng, aspen, dan beech (Jadual 1). satu). Ternyata, banyak tanaman liar dan kebun boleh menjadi cadangan I. crassa. Di atas menunjukkan bahawa semasa mengembangkan langkah-langkah perlindungan, perlu mempertimbangkan kemungkinan mempengaruhi ubi kentang dengan jamur ini. Persediaan yang meluas untuk rawatan ubi kentang yang mengandungi fludioxonil, azoxystrobin, dan difenoconazole telah menunjukkan keberkesanan fungisida terhadap I. crassa.
Karya ini disokong oleh Yayasan Rusia untuk Penyelidikan Asas (Geran No. 20-016-00139).
Artikel itu diterbitkan dalam jurnal "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)